Διερεύνηση της επίδρασης της κροκετίνης στο ένζυμο της καλπαΐνης
| dc.contributor.advisor | Λάμαρη, Φωτεινή | |
| dc.contributor.author | Βούκλιζα, Φωτεινή | |
| dc.contributor.committee | Σπυρούλιας, Γεώργιος | |
| dc.contributor.committee | Αθανασόπουλος, Κωνσταντίνος | |
| dc.contributor.other | Voukliza, Foteini | |
| dc.date.accessioned | 2017-02-10T06:54:26Z | |
| dc.date.available | 2017-02-10T06:54:26Z | |
| dc.date.copyright | 2016-10-20 | |
| dc.degree | Μεταπτυχιακή Εργασία | el |
| dc.description.abstract | Οι καλπαΐνες είναι πρωτεάσες κυστεΐνης με ισχυρή εξάρτηση από το ασβέστιο. Οι δύο κύριες ισομορφές των καλπαϊνών, η καλπαΐνη 1 (ή μ-calpain) και η καλπαΐνη 2 (ή m-calpain), είναι αυτές που εκφράζονται σε όλους τους ιστούς. Η απορρύθμιση του πρωτεολυτικού συστήματος αυτών των πρωτεασών οδηγεί στην εμφάνιση μιας ποικιλίας διαταραχών, μεταξύ των οποίων συγκαταλέγεται και ο οφθαλμικός καταρράκτης. Αυξημένη εισροή ιόντων ασβεστίου στα επιθηλιακά κύτταρα των οφθαλμικών φακών, κατόπιν έκθεσής τους σε οξειδωτικούς παράγοντες, ενεργοποιεί τις πρωτεάσες, κυρίως την καλπαΐνη 2, η οποία κατόπιν αυτού θρυμματίζει και κατακρημνίζει τις κρυσταλλίνες, τις κύριες πρωτεΐνες των φακών, οδηγώντας στη θόλωσή τους και στην εμφάνιση καταρράκτη. Αναστολή της καλπαΐνης 2 επομένως, αναμένεται να καθυστερήσει την καταρρακτογένεση. Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας σε επίμυες, έχει δειχθεί ότι ο κρόκος, στύλοι του άνθους του φυτού Crocus sativus, εμποδίζει την εμφάνιση καταρράκτη. Ο κρόκος είναι πλούσιος σε κροκίνες, γλυκοζίτες του αποκαροτενοειδούς κροκετίνη (8,8’-διαπο-8,8’-καροτενοϊκό οξύ), οι οποίες μεταβολίζονται στο άγλυκο και στο γλυκουρονίδιό τους στον ανθρώπινο οργανισμό. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση της ανασταλτικής δράσης της κροκετίνης στη δράση της καλπαΐνης 2 in vitro. Ο φθορισμομετρικός προσδιορισμός της ικανότητας αναστολής βασίστηκε στην ειδική πέψη του υποστρώματος Suc-Leu-Tyr-AMC από το ένζυμο κατόπιν ενεργοποίησής του με ασβέστιο. Ως θετικό δείγμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας των καλπαϊνών 1 και 2, MDL28170, ενώ η παπαΐνη χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της ειδικότητας της κροκετίνης ως προς την καλπαΐνη 2. Ταυτόχρονα διερευνήθηκε και η επίδραση των ενώσεων, διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος, διμεθυλοκροκετίνη και all-trans ρετινοϊκό οξύ στη δράση της καλπαΐνης 2 και της παπαΐνης. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι η κροκετίνη ανέστειλε τη δράση της καλπαΐνης 2 με τιμή IC50 113,8±2,4 μM. Ο διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος δεν επηρέασε καθόλου την ενεργότητα του ενζύμου, ενώ η διμεθυλοκροκετίνη και το all-trans ρετινοϊκό οξύ προκάλεσαν μια μέτρια αναστολή στη δράση της καλπαΐνης 2. Η κροκετίνη επέφερε αναστολή και στη δράση της παπαΐνης με τιμή IC50 39,00±2,44 μΜ, μικρότερη από την τιμή IC50 για την καλπαΐνη 2, που ωστόσο έχει δειχθεί και σε άλλες περιπτώσεις στη διεθνή βιβλιογραφία, δείχνοντας ότι η κροκετίνη δεν είναι ειδικός αναστολέας της δράσης της καλπαΐνης 2. Η διμεθυλοκροκετίνη και το all-trans ρετινοϊκό οξύ επέφεραν μέτριας κλίμακας αναστολή στη δράση της παπαΐνης, ενώ ο διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος δεν ανέστειλε καθόλου τη δράση του ενζύμου. Στο δεύτερο κύκλο πειραμάτων, προσπαθήσαμε μέσω χρωματογραφίας HPLC και φασματομετρία μάζας UPLC-MS, να διαπιστώσουμε τη δημιουργία ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ της κροκετίνης και της σουλφυδρυλομάδας της γλουταθειόνης, προσομοιάζοντας την αντίδραση μεταξύ κροκετίνης και καλπαΐνης 2. Ως θετικό δείγμα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ο διμεθυλεστέρας του φουμαρικού οξέος ο οποίος από τη βιβλιογραφία είναι γνωστό ότι αντιδρά με γλουταθειόνη. Η ανάλυση με χρωματογραφία HPLC και φασματομετρία μάζας UPLC-MS της κάθε αντίδρασης ανέδειξε την ύπαρξη προϊόντων και στις δύο αντιδράσεις. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία αποδείξαμε για πρώτη φορά ότι η κροκετίνη δύναται να αναστείλει τη δράση της καλπαΐνης 2 in vitro. Η αναστολή φαίνεται να λαμβάνει χώρα μέσω της άμεσης αλληλεπίδρασης του αναστολέα με την κυστεΐνη του ενεργού κέντρου του ενζύμου, μέσω της δημιουργίας ομοιοπολικού δεσμού. Τα αποτελέσματά μας είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη ειδικών αναστολέων της δράσης των καλπαϊνών με βάση την κροκετίνη, με άμεση εφαρμογή στην πρόληψη και στην καθυστέρηση της εμφάνισης του καταρράκτη. | el |
| dc.description.translatedabstract | Calpains are cysteine proteases with a unique dependence on calcium. The two main calpains’ isoforms, calpain 1 (or μ-calpain) and calpain 2 (or m-calpain), are those that are ubiquitously expressed. Deregulation of these proteases’ proteolytic system has as a result the emergence of many disorders, including cataract. Increased influx of calcium ions in the epithelian cells of the lens, after being exposed to oxidative agents, activates proteases, mainly calpain 2, which in turns fragments and precipitates crystallins, the main proteins of the lens, leading to lens opacity and the onset of cataract. Inhibition of calpain 2 would therefore be expected to retard cataract formation. In previous study of our lab with rats, it has been shown that crocus, the styles of the flower of Crocus sativus plant, prevents cataractogenesis. Crocus is rich in crocins, which are glycosides of the apocarotenoid crocetin (8,8’-diapo-8,8’-carotenoic acid), which are metabolized to their aglycon and their glucuronide in the human body. In this study, we investigated the inhibitory effect of crocetin on calpain’s 2 activity in vitro. The fluorometric determination of the inhibitory ability was based on the specific cleavage of the substrate Suc-Leu-Tyr-AMC from the enzyme, after its activation with calcium. Calpain’s 1 and 2 inhibitor, MDL28170, was used as positive control, whereas papain was used in order to compare the specificity of crocetin towards calpain 2. At the same time, it was investigated the effect of dimethyl fumarate, dimethylcrocetin and all-trans retinoic acid on calpain’s 2 and papain’s activity. The results of our experiments showed that crocetin inhibited calpain’s 2 activity with an IC50 value of 113,8±2,4 μM. Dimethyl fumarate did not affect the enzyme’s activity at all, whereas dimethylcrocetin and all-trans retinoic acid had a moderate inhibitory effect on calpain’s 2 activity. Crocetin induced inhibition on papain’s activity as well, with an IC50 value of 39,00±2,44 μΜ, less than that for calpain 2, which however has been reported in another cases in the literature, suggesting that crocetin is not a specific inhibitor of calpain’s 2 activity. Dimethylcrocetin and all-trans retinoic acid induced a moderate inhibition on papain’s activity, whereas dimethyl fumarate did not inhibit the enzyme’s activity at all. In the second round experiments, we tried to verify the formation of covalent bond between crocetin and the sulfur group of cysteine via HPLC and UPLC-MS, in order to simulate the reaction between crocetin and calpain 2. Dimethyl fumarate was used as positive control as it is known from the literature that interacts with glutathione. HPLC and UPLC-MS analysis of each reaction revealed the existence of products for both of them. To sum up, in the present study we proved for the first time that crocetin is able to inhibit calpain’s 2 activity in vitro. The inhibition seems that it takes place through the direct interaction of the inhibitor with the enzyme’s active site cysteine, through the formation of covalent bond. Our results are particularly encouraging and they could be used for the design and development of specific calpains’ inhibitors based on crocetin, with a direct application on prevention and delay of the onset of cataract. | el |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10889/9965 | |
| dc.language.iso | gr | el |
| dc.rights | 0 | el |
| dc.subject | Καλπαΐνη 2 | el |
| dc.subject | Κροκετίνη | el |
| dc.subject | Φθορισμός | el |
| dc.subject.alternative | HPLC | el |
| dc.subject.alternative | Calpain 2 | el |
| dc.subject.alternative | Crocetin | el |
| dc.subject.ddc | 615.324 38 | el |
| dc.title | Διερεύνηση της επίδρασης της κροκετίνης στο ένζυμο της καλπαΐνης | el |
| dc.title.alternative | Investigation of the effect of crocetin on calpain's enzyme | el |
| dc.type | Thesis | el |